再生心肌细胞中Meis1 的辅助因子的使用

研究背景

1、心力衰竭影响全球 2600 多万人，心力衰竭的主要潜在原因是成年人心肌在受伤后无法自行修复。

2、哺乳动物的心脏在受伤后早期能够通过心肌细胞增殖实现再生。

 

■ 重要“人物” 介绍

 

Meis1：由 Meis1 基因表达。Meis1 是 TALE 家族中一种非 Hox 同源异型盒基因。Meis1 是细胞周期阻滞的关键调控因子，在胚胎心肌细胞发育中起重要作用。

 

Hoxb13：同源域转录因子，是前列腺上皮细胞分化的关键调节因子，与细胞周期的调控有关。

 

Calcineurin：钙调神经磷酸酶，细胞质中一种 Ca2+/CaM (钙调蛋白) 依赖性蛋白磷酸酶。当 Calcineurin 被钙激活时，通过其下游转录效应因子 NFAT (活化 T 细胞核因子) 介导肥厚反应，NFAT 直接被 Calcineurin 去磷酸化并发生核转位。

 

图 1. Calcineurin 在糖尿病动脉粥样硬化和心力衰竭中的作用通路 [7]

早在 2013 年，Hesham A. Sadek 研究团队在 Nature 发表的文章中，就将 Meis1 鉴定为心肌细胞增殖的关键转录调节因子，并认为它是心脏再生的潜在治疗靶标。

摘要

1、Hoxb13 是再生心肌细胞中再生关键因子 Meis1 的辅助因子。

 

2、成年小鼠心脏 Meis1 和 Hoxb13 双敲后促进心肌细胞有丝分裂，使肌节处于松散状态，改善心肌梗死后左心室收缩功能。

 

3、Meis1 和 Hoxb13 协同调节心肌细胞成熟和细胞周期。

 

4、Calcineurin 使 Hoxb13 在 Serine 204 位点 (Hoxb13S204) 处去磷酸化，促进其核转运和细胞周期阻滞。

 

研究方法

■ 动物模型

 

条件性心肌细胞特异性 Hoxb13 基因敲除的 Hoxb13-KO 小鼠 (Myh6cre : Hoxb13fl/fl)；

Tamoxifen 诱导型心肌细胞特异性 Hoxb13 蛋白缺失的 Hoxb13-iKO 小鼠 (Myh6mERcremER Hoxb13fl/fl)；

心肌特异性 Myh6cre : Meis1-Hoxb13 双敲除的 DKO 小鼠；

条件性诱导 Meis1 和 Hoxb13蛋白 缺失的 DiKO 小鼠。

 

■ 主要实验方法

 

免疫荧光染色；免疫印迹 (WB) ；免疫共沉淀 (Co-IP) ； 染色质免疫共沉淀结合下 一代测 序 (ChIP-seq) ；磁共振成像；经胸超声心动图检测；TUNEL 分析。

 

实验结果

■ Hoxb13 与 Meis1 的关联

 

此前的研究中，Sadek 的研究团队已经发现 Hox 蛋白家族与 Meis1 有紧密联系。在这次的研究中，通过在心脏损伤后进行再修复的 7 天内 (P1-P7) 检测 Hoxb13 蛋白家族的表达发现，Hoxb13 是再生后心肌细胞中与 Meis1 相互作用的转录因子。

 

图 2. 再生后早期 Hoxb13 的表达与 Meis1 相关
【Postnatal day：再生后天数；
P1：Hyperplastic growth，增生性生长; 
P7：Hypertrophic growth，肥厚性生长】

■ Hoxb13 的遗传缺失

首先，研究团队通过 Hoxb13-KO 小鼠发现，短时间内 Hoxb13 的缺失诱导心肌细胞增殖。另外，在注射 Tamoxifen 后，成年 Hoxb13-iKO 小鼠心脏 Hoxb13 蛋白减少，心肌细胞横截面积 (CSA) 显著减小，单核心肌细胞的比例也显著增加，而双核和多核心肌细胞的比例显著下降。两种小鼠实验结果表明，心肌细胞特异性 Hoxb13 缺失足以诱导成年小鼠心肌有丝分裂。

图 3. Hoxb13 缺失诱导小鼠心肌细胞有丝分裂和左心室射血分数 (LVEF) 的下降

除此之外，成年 Hoxb13-KO 小鼠中诱导了心肌梗死 (MI)，发现 Hoxb13 的敲除可以防止 LVEF 的下降，但是左心室收缩功能并没有改善。总的来说，Hoxb13 的缺失可预防 MI 后收缩功能的逐步恶化，但不会引起实质性功能恢复。

 

 

■ Meis1 和 Hoxb13 蛋白共同缺失

 

Meis1-Hoxb13 的缺失，即 DKO 小鼠心脏中发现了心脏再生的一些特征，如心肌细胞肌小节分解，单核心肌细胞增加。并且观察到成年小鼠中心肌细胞的增殖也很活跃。他们再进行了进一步的研究，以评估 Meis1 和 Hoxb13 缺失对心肌肥大的影响，发现 DKO 心脏表现出运动诱发的生理性肥厚反应减弱。

 

图 4. DKO 小鼠心脏表现出
减弱运动诱发的生理性肥大反应

 

■ DiKO 小鼠中的心脏再生

 

那么成年小鼠心脏中条件性诱导的 Meis1 和 Hoxb13 缺失是否能促进心肌细胞重新进入分裂周期呢？首先，观察发现 DiKO 小鼠的心脏体重比变大，注射 Tamoxifen 后，心肌细胞横截面积减少了约 30％，并且观察心肌细胞的数量与有丝分裂发现，Meis1-Hoxb13 特异性缺失会诱导成年小鼠心室心肌细胞增殖。

 

为了检测心肌细胞增殖水平增加是否有助于成年心脏的修复，对 DiKO 小鼠进行 MI 干预，结果表明，Meis1 和 Hoxb13 的缺失诱导心肌细胞增殖，可以改善 MI 后的左心室收缩功能。

 

图 5. DiKO 小鼠的左心室收缩功能改善

 

另外，Meis1 和 Hoxb13 的体内靶标鉴定发现了三组不同的基因：分别是同时靶标 Meis1 和 Hoxb13 的 272 个基因，1,647 个仅靶标 Meis1 的基因和 1,326 个仅靶标 Hoxb13 的基因。通路分析证明，Meis1  和 Hoxb13 协同调节心肌细胞的分化和细胞周期。

 

■ Calcineurin 调节 Hoxb13

蛋白免疫印迹 (WB) / 免疫共沉淀 (Co-IP)  结果显示  (蛋白提取过程中别忘了使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂来保护它们哟，戳一戳，MCE 官网直接可申请 蛋白酶抑制剂 、 磷酸酶抑制剂  Cocktail  试用装哦！) ，与 Meis1 和 Hoxb13 相似，P7 时钙调神经磷酸酶的催化亚基 CnA 的蛋白水平升高，并且这三种蛋白相互作用。扫描 Calcineurin 对接基序结果表明，Calcineurin 与 Hoxb13 直接相互作用，并可能将它去磷酸化。进一步地，他们找到了作用位点 S204，Calcineurin 依赖性的 Hoxb13S204 去磷酸化作用促进了Hoxb13 的核转运，并促进了细胞周期的阻滞。
 

图 6. CnA 在 P7 天的表达量升高

 

■ Calcineurin 调控心肌细胞增殖

先前有报道表明，心肌细胞中 CnA 的过度表达会导致严重的病理性肥大。一致的，Sadek 研究团队也证明了强制表达激活的 Calcineurin 会导致心肌细胞增生过早转变为心肌细胞肥大，而抑制 Calcineurin 则延长了心肌细胞的增殖期。

图 7. CnA-Tg 心脏显示 LVEF 明显降低，

并伴有明显的疤痕

【CnA-Tg：Ppp3ca (编码 CnA) 基因持续活跃表达；Rcan1-Tg：Rcan1 (表达内源性 Calcineurin 抑制物) 基因持续活跃】

结论

研究确定了 Hoxb13 是心肌细胞分化和增殖的重要调节因子，证明了 Meis1 和 Hoxb13 协同调节心肌细胞成熟和细胞周期，并且发现了 Calcineurin 在调控中重要的作用，靶向 Calcineurin-Hoxb13 轴可能有助于治愈心脏损伤。

 

 

相关产品

Tamoxifen	口服有效的，选择性雌激素受体 (estrogen receptor) 调节剂 (SERM)。可诱导 Hoxb13 基因缺失。
Voclosporin	钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 抑制剂。
Fenvalerate	钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B)  抑制剂，对 PP2B-Aα 的 IC50 为 2-4 nM。
Cyclosporin A	免疫抑制剂，能与亲环素结合，抑制钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 活性的 IC50 值为 7 nM。
Tacrolimus	大环内酯类，与 FK506 结合蛋白 (FKBP) 结合形成复合物并抑制钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) ，从而抑制 T 淋巴细胞信号转导和 IL-2 转录。具有强免疫抑制特性。
Tacrolimus monohydrate
Omecamtiv mecarbil	心脏特异性的肌球蛋白 (cardiac myosin) 激活剂。
Mavacamten	心肌肌球蛋白的调节剂，其在牛心脏和人心脏中的 IC50 值分别为 490，711 nM。
Danicamtiv	心脏肌动蛋白 (cardiac myosin) 的选择性变构活化剂。
Protease Inhibitor Cocktail	蛋白酶抑制剂 Cocktail 可以用于细胞或组织提取物用来增加蛋白稳定性。
Protease Inhibitor Cocktail,  mini-Tablet
Phosphatase Inhibitor  Cocktail I	磷酸酶抑制剂 Cocktail I/ II/ III 广谱性抑制酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPs)，用于维持蛋白的磷酸化状态。
Phosphatase Inhibitor  Cocktail II
Phosphatase Inhibitor  Cocktail III